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Nucleasa

Nucleasa

Una nucleasa (también conocida arcaicamente como nucleodepolimerasa o polinucleotidasa ) es una enzima capaz de escindir los enlaces fosfodiéster entre nucleótidos de ácidos nucleicos. Las nucleasas afectan de manera diversa las roturas de cadena sencilla y doble en sus moléculas objetivo. En los organismos vivos, son maquinaria esencial para muchos aspectos de la reparación del ADN. Los defectos en ciertas nucleasas pueden causar inestabilidad genética o inmunodeficiencia. Las nucleasas también se usan ampliamente en la clonación molecular.

Hay dos clasificaciones principales basadas en el lugar de actividad. Las exonucleasas digieren los ácidos nucleicos de los extremos. Las endonucleasas actúan sobre regiones en el medio de moléculas diana. Se subcategorizan además como desoxirribonucleasas y ribonucleasas. El primero actúa sobre el ADN, el segundo sobre el ARN.

Historia

A fines de la década de 1960, los científicos Stuart Linn y Werner Arber aislaron ejemplos de los dos tipos de enzimas responsables de la restricción del crecimiento de fagos en la bacteria Escherichia coli (E. coli). Una de estas enzimas agregó un grupo metilo al ADN, generando ADN metilado, mientras que la otra escindió el ADN no metilado en una amplia variedad de ubicaciones a lo largo de la molécula. El primer tipo de enzima se llamó "metilasa" y el otro una "nucleasa de restricción". Estas herramientas enzimáticas eran importantes para los científicos que reunían las herramientas necesarias para "cortar y pegar" moléculas de ADN. Lo que se necesitaba entonces era una herramienta que cortara el ADN en sitios específicos, en lugar de sitios aleatorios a lo largo de la longitud de la molécula, para que los científicos pudieran cortar las moléculas de ADN de una manera predecible y reproducible.

Un acontecimiento importante se produjo cuando HO Smith, KW Wilcox y TJ Kelley, trabajando en la Universidad Johns Hopkins en 1968, aislaron y caracterizaron la primera nucleasa de restricción cuyo funcionamiento dependía de una secuencia de nucleótidos de ADN específica. Al trabajar con la bacteria Haemophilus influenzae, este grupo aisló una enzima, llamada Hind II, que siempre corta las moléculas de ADN en un punto particular dentro de una secuencia específica de seis pares de bases. Descubrieron que la enzima Hind II siempre corta directamente en el centro de esta secuencia (entre los pares de bases 3 y 4)

Sistema de clasificación numérica

La mayoría de las nucleasas están clasificadas por el número de la Comisión de Enzimas del "Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular" como hidrolasas (número 3 de la CE). Las nucleasas pertenecen al igual que la fosfodiesterasa, la lipasa y la fosfatasa a las esterasas (número EC 3.1), un subgrupo de las hidrolasas. Las esterasas a las que pertenecen las nucleasas se clasifican con los números CE 3.1.11 - Número CE 3.1.31.

Estructura

La estructura primaria de la nucleasa está, en general, pobremente conservada y mínimamente conservada en los sitios activos, cuyas superficies comprenden principalmente residuos de aminoácidos ácidos y básicos. Las nucleasas se pueden clasificar en familias plegables.

Reconocimiento del sitio

Una nucleasa debe asociarse con un ácido nucleico antes de que pueda escindir la molécula. Eso implica un grado de reconocimiento. Las nucleasas emplean diversas asociaciones inespecíficas y específicas en sus modos de reconocimiento y unión. Ambos modos juegan papeles importantes en los organismos vivos, especialmente en la reparación del ADN.

Las endonucleasas inespecíficas involucradas en la reparación del ADN pueden escanear el ADN en busca de secuencias objetivo o daños. Dicha nucleasa se difunde a lo largo del ADN hasta que encuentra un objetivo, sobre el cual los residuos de su sitio activo interactúan con los grupos químicos del ADN. En el caso de endonucleasas como EcoRV, BamHI y PvuII, esta unión no específica implica interacciones electrostáticas entre el área superficial mínima de la proteína y el ADN. Esta asociación débil deja la forma general del ADN sin deformar, quedando en forma de B.

Una nucleasa específica del sitio forma asociaciones mucho más fuertes por el contrario. Atrae el ADN al surco profundo de su dominio de unión al ADN. Esto da como resultado una deformación significativa de la estructura terciaria del ADN y se logra con una superficie rica en residuos básicos (cargados positivamente). Se involucra en una extensa interacción electrostática con el ADN.

Algunas nucleasas involucradas en la reparación del ADN exhiben una especificidad de secuencia parcial. sin embargo, la mayoría son inespecíficos, en cambio reconocen anormalidades estructurales producidas en el esqueleto del ADN por desajustes de pares de bases.

Estructura nucleasa específica

Para detalles ver colgajo endonucleasa.

Secuencia de nucleasa específica

Enzima Fuente Secuencia de reconocimiento Cortar
Hind II Haemophilus influenzae

5'– GTYRAC – 3 '
3'– CARYTG – 5 '

5'– GTY RAC – 3 '
3'– CAR YTG – 5 '

R = A o G; Y = C o T

Se han aislado más de 900 enzimas de restricción, algunas específicas de secuencia y otras no, de más de 230 cepas de bacterias desde el descubrimiento inicial de Hind II. Estas enzimas de restricción generalmente tienen nombres que reflejan su origen: la primera letra del nombre proviene del género y las segundas letras provienen de la especie de la célula procariota de la que se aislaron. Por ejemplo, Eco RI proviene de la bacteria Escherichia coli RY13, mientras que HindII proviene de la cepa Rd. De Haemophilus influenzae. Los números que siguen a los nombres de las nucleasas indican el orden en que se aislaron las enzimas de cepas individuales de bacterias: Eco RI, Eco RII.

Endonucleasas

Una endonucleasa de restricción funciona "escaneando" la longitud de una molécula de ADN. Una vez que encuentra su secuencia de reconocimiento específica particular, se unirá a la molécula de ADN y hará un corte en cada una de las dos cadenas principales de azúcar y fosfato. Las posiciones de estos dos cortes, tanto entre sí como con la secuencia de reconocimiento en sí, están determinadas por la identidad de la endonucleasa de restricción. Las diferentes endonucleasas producen diferentes conjuntos de cortes, pero una endonucleasa siempre cortará una secuencia de bases particular de la misma manera, sin importar en qué molécula de ADN esté actuando. Una vez que se han realizado los cortes, la molécula de ADN se romperá en fragmentos.

Corte escalonado

No todas las endonucleasas de restricción se cortan simétricamente y dejan extremos romos como el Hind II descrito anteriormente. Muchas endonucleasas cortan las cadenas principales de ADN en posiciones que no están directamente opuestas entre sí, creando voladizos. Por ejemplo, la nucleasa Eco RI tiene la secuencia de reconocimiento 5'— GAATTC — 3 '.

Enzima Fuente Secuencia de reconocimiento Cortar
Hind III Haemophilus influenzae
5'– AAGCTT – 3 '
3'– TTCGAA – 5 '
5'– A AGCTT – 3 '
3'– TTCGA A – 5 '
Eco RI Escherichia coli
5'– GAATTC-3 '
3'– CTTAAG – 5 '
5'– G AATTC – 3 '
3'– CTTAA G – 5 '
Bam HI Bacillus amyloliquefaciens
5'– GGATCC – 3 '
3'– CCTAGG – 5 '
5'– G GATCC – 3 '
3'– CCTAG G – 5 '

Cuando la enzima encuentra esta secuencia, escinde cada columna vertebral entre los residuos de la base G y A más cercana. Una vez que se han realizado los cortes, los fragmentos resultantes se mantienen unidos solo por los enlaces de hidrógeno relativamente débiles que mantienen las bases complementarias entre sí. La debilidad de estos enlaces permite que los fragmentos de ADN se separen entre sí. Cada fragmento resultante tiene un extremo sobresaliente de 5 'compuesto de bases no emparejadas. Otras enzimas crean cortes en la columna vertebral del ADN que resultan en extremos sobresalientes de 3 '. Los extremos sobresalientes, tanto 3 'como 5', a veces se denominan "extremos adhesivos" porque tienden a unirse con secuencias complementarias de bases. En otras palabras, si una longitud no emparejada de bases 5'— AATT — 3 'encuentra otra longitud no emparejada con la secuencia 3'— TTAA — 5', se unirán entre sí, son "pegajosas" la una para la otra. La enzima ligasa se usa para unir las cadenas principales de fosfato de las dos moléculas. El origen celular, o incluso el origen de la especie, de los extremos adhesivos no afecta su adherencia. Cualquier par de secuencias complementarias tenderá a unirse, incluso si una de las secuencias proviene de una longitud de ADN humano, y la otra proviene de una longitud de ADN bacteriano. De hecho, es esta calidad de adherencia la que permite la producción de moléculas de ADN recombinante, moléculas que están compuestas de ADN de diferentes fuentes y que ha dado origen a la tecnología de ingeniería genética.

Papel en la naturaleza

Reparación de ADN

Dado que todas las células dependen del ADN como medio de información genética, el control de calidad genética es una función esencial de todos los organismos. La replicación del ADN es un proceso propenso a errores, y las propias moléculas de ADN son vulnerables a la modificación por muchos factores estresantes metabólicos y ambientales. Ejemplos ubicuos incluyen especies reactivas de oxígeno, cerca de radiación ultravioleta e ionizante. Muchas nucleasas participan en la reparación del ADN al reconocer los sitios dañados y escindirlos del ADN circundante. Estas enzimas funcionan independientemente o en complejos. La mayoría de las nucleasas involucradas en la reparación del ADN no son específicas de la secuencia. Reconocen los sitios de daño a través de la deformación de la estructura secundaria de ADN bicatenario (dsDNA).

Corrección de pruebas de replicación

Durante la replicación del ADN, las ADN polimerasas alargan nuevas cadenas de ADN contra cadenas de plantillas complementarias. La mayoría de las ADN polimerasas comprenden dos dominios enzimáticos diferentes: una polimerasa y una exonucleasa de corrección de pruebas. La polimerasa alarga la nueva cadena en la dirección 5 '→ 3'. La exonucleasa elimina nucleótidos erróneos de la misma cadena en la dirección 3 '→ 5'. Esta actividad de exonucleasa es esencial para que la ADN polimerasa pueda corregir. Las deleciones que inactivan o eliminan estas nucleasas aumentan las tasas de mutación y mortalidad en los microbios afectados y el cáncer en ratones.

Horquilla de replicación detenida

Muchas formas de daño en el ADN detienen la progresión de la horquilla de replicación, lo que hace que las ADN polimerasas y la maquinaria asociada abandonen la horquilla. Luego debe ser procesado por proteínas específicas de la horquilla. El más notable es MUS81. Las eliminaciones de las cuales causan sensibilidad a los daños por UV o metilación en levaduras, además de defectos meióticos.

Procesamiento de fragmentos Okazaki

Una tarea omnipresente en las células es la eliminación de los cebadores de ARN del fragmento Okazaki de la replicación. La mayoría de estos cebadores se extirpan del ADN de cadena rezagada sintetizado recientemente por endonucleasas de la familia RNasa H. En eucariotas y en arqueas, la aleta endonucleasa FEN1 también participa en el procesamiento de fragmentos de Okazaki.

Reparación de desajustes

La reparación de la discordancia de ADN en cualquier organismo dado se efectúa mediante un conjunto de endonucleasas específicas de discordancia. En los procariotas, este papel lo desempeñan principalmente MutSLH y proteínas asociadas a la reparación de parches muy cortos (reparación de VSP).

El sistema MutSLH (que comprende MutS, MutL y MutH) corrige mutaciones puntuales y giros pequeños. MutS reconoce y se une a los desajustes, donde recluta MutL y MutH. MutL media la interacción entre MutS y MutH, y mejora la actividad endonucleásica de este último. MutH reconoce los sitios hemimetilados 5'-GATC-3 'y escinde al lado de la G de la cadena no metilada (la cadena sintetizada más recientemente).

La reparación de VSP es iniciada por la endonucleasa Vsr. Corrige un desajuste específico de T / G causado por la desaminación espontánea de citosinas metiladas a timinas. Vsr reconoce la secuencia 5'-CTWGG-3 ', donde corta la cadena de ADN en el lado 5' de la timina no coincidente (subrayada en la secuencia anterior). Una de las exonucleasas RecJ, ExoVII o ExoI degrada el sitio antes de que la ADN polimerasa vuelva a sintetizar la brecha en la cadena.

Reparación de escisión de base

La formación de sitios AP es una ocurrencia común en dsDNA. Es el resultado de la hidrólisis espontánea y la actividad de las glicosilasas de ADN como un paso intermedio en la reparación de la escisión de la base. Estos sitios AP son eliminados por las endonucleasas AP, que efectúan roturas de cadena sencilla alrededor del sitio.

Reparación de escisión de nucleótidos

La reparación por escisión de nucleótidos, que no debe confundirse con la reparación por escisión de base, implica la eliminación y el reemplazo de nucleótidos dañados. Los casos de reticulación, aductos y lesiones (generados por luz ultravioleta o especies reactivas de oxígeno) pueden desencadenar esta vía de reparación. Los tramos cortos de ADN monocatenario que contienen dicho nucleótido dañado se eliminan del ADN dúplex mediante endonucleasas separadas que producen cortes en el flujo ascendente y descendente del daño. Las deleciones o mutaciones que afectan a estas nucleasas provocan una mayor sensibilidad al daño ultravioleta y la carcinogénesis. Tales anormalidades pueden incluso afectar el desarrollo neural.

En bacterias, ambos cortes ejecutados por el complejo UvrB-UvrC. En la levadura en ciernes, Rad2 y el complejo Rad1-Rad10 realizan los cortes de 5 'y 3', respectivamente. En mamíferos, los homólogos XPG y XPF-ERCC1 afectan las mismas mellas respectivas.

Reparación de rotura de doble hebra

Las roturas de doble cadena, tanto intencionales como no intencionales, ocurren regularmente en las células. Las roturas no intencionales se generan comúnmente mediante radiación ionizante, diversos agentes químicos exógenos y endógenos y horquillas de replicación detenidas. Las interrupciones intencionales se generan como intermediarios en la meiosis y la recombinación V (D) J, que se reparan principalmente mediante recombinación homóloga y unión final no homóloga. Ambos casos requieren que los extremos en roturas de doble cadena sean procesados ​​por nucleasas antes de que la reparación pueda llevarse a cabo. Una de tales nucleasas es Mre11 complejado con Rad50. Las mutaciones de Mre11 pueden precipitar un trastorno similar a la ataxia-telangiectasia.

La recombinación V (D) J implica abrir estructuras de bucles de vástago asociadas con roturas de doble cadena y, posteriormente, unir ambos extremos. El complejo Artemis-DNAPKcs participa en esta reacción. Aunque Artemis exhibe actividad de exonucleasa de ADN ss 5 '→ 3' cuando está solo, su formación de complejos con DNA-PKcs permite el procesamiento endonucleásico de los bucles del tallo. Los defectos de cualquiera de las proteínas confieren inmunodeficiencia severa.

La recombinación homóloga, por otro lado, involucra dos dúplex de ADN homólogos conectados por D-loops o uniones de Holliday. En las bacterias, las endonucleasas como RuvC resuelven las uniones de Holliday en dos dsDNA separados al dividir las uniones en dos sitios simétricos cerca del centro de la unión. En eucariotas, FEN1, XPF-ERCC1 y MUS81 cortan los bucles D, y Cce1 / Ydc2 procesa las uniones de Holliday en las mitocondrias.

Meganucleasas

La frecuencia con la que una nucleasa particular cortará una molécula de ADN dada depende de la complejidad del ADN y la longitud de la secuencia de reconocimiento de la nucleasa; Debido a la probabilidad estadística de encontrar las bases en un orden particular por casualidad, una secuencia de reconocimiento más larga dará como resultado una digestión menos frecuente. Por ejemplo, se predeciría que una secuencia de cuatro bases dada (correspondiente al sitio de reconocimiento de una nucleasa hipotética) ocurriría cada 256 pares de bases en promedio (donde 4 ^ 4 = 256), pero se esperaría cualquier secuencia de seis bases dada ocurrir una vez cada 4,096 pares de bases en promedio (4 ^ 6 = 4096).

Una familia única de nucleasas son las meganucleasas, que se caracterizan por tener secuencias de reconocimiento más grandes y, por lo tanto, menos comunes, que consisten en 12 a 40 pares de bases. Estas nucleasas son particularmente útiles para la ingeniería genética y las aplicaciones de ingeniería del genoma en organismos complejos como plantas y mamíferos, donde los genomas más grandes (que suman miles de millones de pares de bases) darían como resultado una digestión frecuente y perjudicial específica del sitio utilizando nucleasas tradicionales.