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Morfolino

Morfolino

Un morfolino , también conocido como un oligómero de morfolino y como un oligómero de morfolino de fosforodiamidato (PMO), es un tipo de molécula de oligómero (coloquialmente, un oligo ) utilizado en biología molecular para modificar la expresión génica. Su estructura molecular tiene bases de ADN unidas a una columna vertebral de anillos de metilenmorfolina unidos a través de grupos fosforodiamidato. Los morfolinos bloquean el acceso de otras moléculas a pequeñas secuencias específicas (~ 25 bases) de las superficies de apareamiento de bases del ácido ribonucleico (ARN). Los morfolinos se utilizan como herramientas de investigación para la genética inversa al derribar la función genética.

Este artículo aborda solo los oligómeros antisentido de Morfolino, que son análogos de ácido nucleico. La palabra "Morfolino" puede aparecer en otros nombres químicos, en referencia a los productos químicos que contienen un anillo de morfolina de seis miembros. Para ayudar a evitar la confusión con otras moléculas que contienen morfolina, al describir oligos, "Morfolino" a menudo se escribe con mayúscula como nombre comercial, pero este uso no es consistente en la literatura científica. Los oligos morfolinos a veces se denominan PMO (para el oligómero morfolino de fosforodiamidato), especialmente en la literatura médica. Vivo-Morpholinos y PPMO son formas modificadas de Morpholinos con grupos químicos unidos covalentemente para facilitar la entrada en las células.

La eliminación de genes se logra al evitar que las células produzcan una proteína específica. Derribar la expresión génica es un método para aprender sobre la función de una proteína en particular; de manera similar, hacer que un exón específico se empalme del transcrito de ARN que codifica una proteína puede ayudar a determinar la función del resto de la proteína codificada por ese exón o, en ocasiones, puede reducir la actividad de la proteína por completo. Estas moléculas se han aplicado a estudios en varios organismos modelo, incluidos ratones, peces cebra, ranas y erizos de mar. Los morfolinos también pueden modificar el empalme del pre-ARNm o inhibir la maduración y la actividad del miARN. Las técnicas para dirigir Morfolinos a ARN y entregar Morfolinos a las células se han revisado recientemente en un artículo de revista y en forma de libro.

Los morfolinos se están desarrollando como terapias farmacéuticas dirigidas contra organismos patógenos como bacterias o virus y enfermedades genéticas. El medicamento Morpholino eteplirsen de Sarepta Therapeutics recibió la aprobación acelerada de la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos para el tratamiento de algunas mutaciones que causan distrofia muscular de Duchenne.

Historia

Los oligos morfolinos fueron concebidos por Summerton (Gene Tools) en AntiVirals Inc. (ahora Sarepta Therapeutics) y originalmente desarrollados en colaboración con Weller.

Estructura

Los morfolinos son moléculas sintéticas que son producto de un rediseño de la estructura natural del ácido nucleico. Por lo general, de 25 bases de longitud, se unen a secuencias complementarias de ARN o ADN monocatenario mediante emparejamiento de bases de ácido nucleico estándar. En términos de estructura, la diferencia entre los morfolinos y el ADN es que, si bien los morfolinos tienen bases de ácido nucleico estándar, esas bases están unidas a anillos de metilenmorfolina unidos a través de grupos fosforodiamidato en lugar de fosfatos. La figura compara las estructuras de las dos cadenas representadas allí, una de ARN y la otra de un Morfolino. El reemplazo de fosfatos aniónicos con los grupos de fosforodiamidato sin carga elimina la ionización en el rango fisiológico de pH habitual, por lo que los morfolinos en organismos o células son moléculas sin carga. Toda la columna vertebral de un Morpholino está hecha de estas subunidades modificadas.

Función

Los morfolinos no desencadenan la degradación de sus moléculas de ARN diana, a diferencia de muchos tipos estructurales antisentido (p. Ej., Fosforotioatos, ARNip). En cambio, los morfolinos actúan mediante "bloqueo estérico", uniéndose a una secuencia diana dentro de un ARN, inhibiendo moléculas que de otro modo podrían interactuar con el ARN. Los oligos morfolinos a menudo se usan para investigar el papel de un transcrito de ARNm específico en un embrión. Los biólogos del desarrollo inyectan oligos de morfolino en huevos o embriones de pez cebra, rana africana con garras (Xenopus), erizo de mar y killifish ( F. heteroclitus ) que producen embriones de morfante, o electroporan morfolinos en embriones de pollo en etapas posteriores de desarrollo. Con sistemas de suministro citosólicos apropiados, los morfolinos son efectivos en el cultivo celular. Los Vivo-Morfolinos, en los que el oligo está unido covalentemente a un dendrímero de liberación, ingresan a las células cuando se administran sistémicamente en animales adultos o en cultivos de tejidos.

Expresión génica normal en eucariotas

En los organismos eucariotas, el pre-ARNm se transcribe en el núcleo, los intrones se empalman, luego el ARNm maduro se exporta desde el núcleo al citoplasma. La pequeña subunidad del ribosoma generalmente comienza uniéndose al extremo 5 'del ARNm y se une allí por varios otros factores de iniciación eucariotas, formando el complejo de iniciación. El complejo de iniciación explora a lo largo de la cadena de ARNm hasta que alcanza un codón de inicio, y luego la subunidad grande del ribosoma se une a la subunidad pequeña y comienza la traducción de una proteína. Todo este proceso se conoce como expresión génica; Es el proceso por el cual la información en un gen, codificada como una secuencia de bases en el ADN, se convierte en la estructura de una proteína. Un Morpholino puede modificar el empalme, bloquear la traducción o bloquear otros sitios funcionales en el ARN dependiendo de la secuencia de bases del Morpholino.

Bloqueo de traducción

Unidos a la región 5 'no traducida del ARN mensajero (ARNm), los morfolinos pueden interferir con la progresión del complejo de iniciación ribosomal desde la tapa 5' hasta el codón de inicio. Esto impide la traducción de la región de codificación de la transcripción objetivo (llamada expresión genética "derribando"). Esto es útil experimentalmente cuando un investigador desea conocer la función de una proteína en particular; Los morfolinos proporcionan un medio conveniente para derribar la expresión de la proteína y aprender cómo ese derribo cambia las células o el organismo. Algunos morfolinos reducen la expresión de manera tan efectiva que, después de la degradación de las proteínas preexistentes, las proteínas objetivo se vuelven indetectables por la transferencia Western.

En 2016, se descubrió que una PMO conjugada con péptidos sintéticos (PPMO) inhibía la expresión de la metalo-beta-lactamasa de Nueva Delhi, una enzima que muchas bacterias resistentes a los medicamentos usan para destruir los carbapenems.

Modificación de empalme pre-ARNm

Los morfolinos pueden interferir con los pasos de procesamiento del pre-ARNm ya sea evitando que los complejos de ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (spRNP) que se unen se unan a sus objetivos en los bordes de los intrones en una cadena de pre-ARNm, o bloqueando la base de adenina nucleófila y evitándola de formar la estructura de empalme lariat, o al interferir con la unión de proteínas reguladoras de empalme, tales como silenciadores de empalme y potenciadores de empalme. La prevención de la unión de snRNP U1 (en el sitio donante) o U2 / U5 (en el sitio de fracción de polipirimidina y aceptor) puede causar un empalme modificado, excluyendo comúnmente los exones del ARNm maduro. Apuntar a algunos objetivos de empalme da como resultado inclusiones de intrones, mientras que la activación de sitios de empalme crípticos puede conducir a inclusiones o exclusiones parciales. Los objetivos de snRNP U11 / U12 también se pueden bloquear. La modificación del empalme se puede analizar convenientemente por reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) y se ve como un cambio de banda después de la electroforesis en gel de los productos de RT-PCR.

Otras aplicaciones: bloqueo de otros sitios de ARNm y uso como sondas

Los morfolinos se han usado para bloquear la actividad y la maduración de miARN. Los morfolinos marcados con fluoresceína combinados con anticuerpos específicos de fluoresceína se pueden usar como sondas para la hibridación in situ de miARN. Los morfolinos pueden bloquear la actividad de la ribozima. Morpholinos ha inhibido las funciones U2 y U12 snRNP. Los morfolinos dirigidos a secuencias de ARNm "resbaladizas" dentro de las regiones de codificación de proteínas pueden inducir cambios de marco traduccionales. Los morfolinos pueden bloquear secuencias de edición de ARN, colas poli-A y translocación. Las actividades de Morfolino contra esta variedad de objetivos sugieren que los Morfolinos pueden usarse como una herramienta de propósito general para bloquear las interacciones de proteínas o ácidos nucleicos con ARNm.

Especificidad, estabilidad y efectos no antisentido.

Los morfolinos se han convertido en una herramienta estándar de eliminación en los sistemas embrionarios de animales, que tienen un rango más amplio de expresión génica que las células adultas y pueden verse fuertemente afectados por una interacción fuera del objetivo. Después de las inyecciones iniciales en embriones de rana o pescado en las etapas de células individuales o pocas células, los efectos de Morfolino se pueden medir hasta cinco días después, después de que la mayoría de los procesos de organogénesis y diferenciación hayan pasado, con fenotipos observados consistentes con el gen objetivo noquear. Los oligos de control con secuencias irrelevantes generalmente no producen cambios en el fenotipo embrionario, evidencia de la especificidad de secuencia del oligo Morfolino y la falta de efectos no antisentido. La dosis requerida para un derribo se puede reducir mediante la coinyección de varios oligos de Morfolino que se dirigen al mismo ARNm, que es una estrategia efectiva para reducir o eliminar las interacciones de ARN fuera del objetivo dependientes de la dosis.

Los experimentos de rescate de ARNm a veces pueden restaurar el fenotipo de tipo salvaje a los embriones y proporcionar evidencia de la especificidad de un Morfolino. En un rescate de ARNm, un Morpholino se coinyecta con un ARNm que codifica la proteína del morfolino. Sin embargo, el ARNm de rescate tiene un 5'-UTR modificado (región no traducida) para que el ARNm de rescate no contenga ningún objetivo para el Morfolino. La región de codificación del ARNm de rescate codifica la proteína de interés. La traducción del ARNm de rescate reemplaza la producción de la proteína que fue derribada por el Morfolino. Dado que el ARNm de rescate no afectaría los cambios fenotípicos debido a la modulación de la expresión génica fuera del objetivo de Morpholino, este retorno al fenotipo de tipo salvaje es una prueba más de la especificidad de Morpholino. En algunos casos, la expresión ectópica del ARN de rescate hace imposible la recuperación del fenotipo de tipo salvaje.

En los embriones, los morfolinos se pueden analizar en mutantes nulos para verificar interacciones inesperadas de ARN, luego se pueden usar en un embrión de tipo salvaje para revelar el fenotipo de caída aguda. El fenotipo derribo suele ser más extremo que el fenotipo mutante; en el mutante, los efectos de perder el gen nulo pueden ocultarse mediante compensación genética.

Debido a su columna vertebral completamente antinatural, los morfolinos no son reconocidos por las proteínas celulares. Las nucleasas no degradan los morfolinos, ni se degradan en el suero o en las células.

Hasta el 18% de los morfolinos parecen inducir fenotipos no relacionados con el objetivo, incluida la muerte celular en el sistema nervioso central y los tejidos somáticos de los embriones de pez cebra. La mayoría de estos efectos se deben a la activación de la apoptosis mediada por p53 y pueden suprimirse mediante la coinyección de un Morfolino anti-p53 junto con el Morfolino experimental. Además, el efecto apoptótico mediado por p53 de un derribo de Morfolino se ha fenocopiado utilizando otro tipo estructural antisentido, lo que muestra que la apoptosis mediada por p53 es una consecuencia de la pérdida de la proteína objetivo y no una consecuencia del tipo de oligo derribo. Parece que estos efectos son específicos de la secuencia; como en la mayoría de los casos, si un Morpholino está asociado con efectos que no son el objetivo, el Morpholino de desajuste de 4 bases no activará estos efectos.

Un motivo de preocupación en el uso de morfolinos es el potencial de efectos "fuera del objetivo". Si un fenotipo de morfante observado se debe a la eliminación prevista o una interacción con un ARN fuera del objetivo, a menudo se puede abordar en embriones ejecutando otro experimento para confirmar que el fenotipo de morfante observado resulta de la eliminación del objetivo esperado. Esto se puede hacer recapitulando el fenotipo morfante con un segundo Morpholino no superpuesto dirigido al mismo ARNm, mediante la confirmación de los fenotipos observados comparándolo con una cepa mutante (aunque la compensación oscurecerá un fenotipo en algunos mutantes), probando el Morpholino en un fondo mutante nulo para detectar cambios fenotípicos adicionales o por métodos negativos dominantes. Como se mencionó anteriormente, el rescate de los fenotipos observados mediante la inyección conjunta de un ARNm de rescate es, cuando sea factible, una prueba confiable de especificidad de un Morfolino.

Entrega

Para que un Morpholino sea efectivo, debe entregarse más allá de la membrana celular al citosol de una célula. Una vez en el citosol, los morfolinos se difunden libremente entre el citosol y el núcleo, como lo demuestra la actividad de modificación de empalme nuclear de los morfolinos observada después de la microinyección en el citosol de las células. Se utilizan diferentes métodos para la administración a embriones, células cultivadas o animales adultos. Un aparato de microinyección generalmente se usa para la administración a un embrión, y las inyecciones se realizan con mayor frecuencia en la etapa de células individuales o pocas células; Un método alternativo para el suministro embrionario es la electroporación, que puede suministrar oligos a los tejidos de las etapas embrionarias posteriores. Las técnicas comunes para el suministro a las células cultivadas incluyen el péptido Endo-Porter (que hace que el morfolino se libere de los endosomas), el sistema de suministro especial (ya no está disponible comercialmente, utilizó un heteroduplex de morfolino-ADN y un reactivo de suministro de polietilenimina etoxilada), electroporación o carga de raspado.

El suministro a los tejidos adultos suele ser difícil, aunque existen algunos sistemas que permiten la absorción útil de oligos morfolino no modificados (incluida la absorción en las células musculares con distrofia muscular de Duchenne o las células endoteliales vasculares estresadas durante la angioplastia con balón). Aunque penetran eficazmente a través de los espacios intercelulares en los tejidos, los PMO no conjugados tienen una distribución limitada en el citosol y los espacios nucleares dentro de los tejidos sanos después de la administración IV. El suministro sistémico a muchas células en organismos adultos se puede lograr mediante el uso de conjugados covalentes de oligos morfolinos con péptidos que penetran en las células y, si bien la toxicidad se ha asociado con dosis moderadas de los conjugados peptídicos, se han utilizado in vivo para un suministro eficaz de oligo en dosis inferiores a las que causan toxicidad observada. Un dendrímero octa-guanidinio unido al extremo de un Morfolino puede liberar el oligo modificado (llamado Vivo-Morfolino) de la sangre al citosol. Los Morfolinos habilitados para el parto, como los conjugados peptídicos y los Vivo-Morfolinos, son prometedores como terapéuticos para las enfermedades virales y genéticas.