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Ensayo cometa

Ensayo cometa

El ensayo de electroforesis en gel de una sola célula ( SCGE , también conocido como ensayo cometa ) es una técnica sencilla y sensible para la detección de daños en el ADN a nivel de la célula eucariota individual. Fue desarrollado por primera vez por Östling & Johansson en 1984 y luego modificado por Singh et al. en 1988. Desde entonces, ha aumentado su popularidad como técnica estándar para evaluar el daño / reparación del ADN, el biomonitoreo y las pruebas de genotoxicidad. Implica la encapsulación de las células en una suspensión de agarosa de bajo punto de fusión, la lisis de las células en condiciones neutras o alcalinas (pH> 13) y la electroforesis de las células lisadas suspendidas. El término "cometa" se refiere al patrón de migración de ADN a través del gel de electroforesis, que a menudo se asemeja a un cometa.

El ensayo cometa (electroforesis en gel de una sola célula) es un método simple para medir las roturas de la cadena del ácido desoxirribonucleico (ADN) en las células eucariotas. Las células incrustadas en agarosa en un portaobjetos de microscopio se lisan con detergente y alto contenido de sal para formar nucleoides que contienen bucles de ADN superenrollados unidos a la matriz nuclear. La electroforesis a pH alto produce estructuras que se parecen a los cometas, observadas por microscopía de fluorescencia; La intensidad de la cola del cometa en relación con la cabeza refleja el número de roturas de ADN. La base probable para esto es que los bucles que contienen una ruptura pierden su superenrollamiento y quedan libres para extenderse hacia el ánodo. Esto es seguido por un análisis visual con tinción de ADN y cálculo de fluorescencia para determinar la extensión del daño en el ADN. Esto se puede realizar mediante puntuación manual o automáticamente mediante software de imágenes.

Procedimiento

Encapsulamiento

Una muestra de células, derivadas de un cultivo celular in vitro o de un sujeto de prueba in vivo se dispersa en células individuales y se suspende en agarosa fundida de bajo punto de fusión a 37 ° C. Esta mono suspensión se moldea en un portaobjetos de microscopio. Un cubreobjetos de vidrio se mantiene en ángulo y la mono suspensión se aplica al punto de contacto entre el cubreobjetos y el portaobjetos. A medida que el cubreobjetos se baja sobre el portaobjetos, la agarosa fundida se extiende para formar una capa delgada. La agarosa se gelifica a 4 ° C y se retira el cubreobjetos.

La agarosa forma una matriz de fibras de carbohidratos que encapsulan las células y las anclan en su lugar. Se considera que la agarosa es osmótica neutra, por lo tanto, las soluciones pueden penetrar en el gel y afectar a las células sin que las células cambien de posición.

En un estudio in vitro, las células estarían expuestas a un agente de prueba, típicamente luz UV, radiación ionizante o un químico genotóxico, para inducir daños en el ADN de las células encapsuladas. Para la calibración, el peróxido de hidrógeno se usa generalmente para proporcionar un nivel estandarizado de daño en el ADN.

Lisis

Los portaobjetos se sumergen en una solución que hace que las células se lisen. La solución de lisis que se usa a menudo en el ensayo del cometa consiste en una sal acuosa altamente concentrada (a menudo, se puede usar sal de mesa común) y un detergente (como Triton X-100 o sarcosinato). El pH de la solución de lisis se puede ajustar (generalmente entre pH neutro y alcalino) dependiendo del tipo de daño que el investigador está investigando.

La sal acuosa altera las proteínas y sus patrones de unión dentro de la célula, así como también altera el contenido de ARN de la célula. El detergente disuelve las membranas celulares. Mediante la acción de la solución de lisis, las células se destruyen. Todas las proteínas, ARN, membranas y constituyentes citoplasmáticos y nucleoplásmicos se rompen y se difunden en la matriz de agarosa. Solo queda el ADN de la célula y se desentraña para llenar la cavidad en la agarosa que antes llenaba toda la célula. Esta estructura se llama nucleoide (un término general para una estructura en la que se concentra el ADN).

Electroforesis

Después de la lisis de las células (típicamente de 1 a 2 horas a 4 ° C), los portaobjetos se lavan con agua destilada para eliminar todas las sales y se sumergen en una segunda solución: una solución de electroforesis. Nuevamente, esta solución puede tener su pH ajustado dependiendo del tipo de daño que se está investigando.

Los portaobjetos se dejan durante ~ 20 minutos en la solución de electroforesis antes de aplicar un campo eléctrico. En condiciones alcalinas, la doble hélice del ADN se desnaturaliza y el nucleoide se vuelve monocatenario.

Se aplica un campo eléctrico (típicamente 1 V / cm) durante ~ 20 minutos. Los portaobjetos se neutralizan a pH 7, se tiñen con una mancha fluorescente específica de ADN y se analizan usando un microscopio con un CCD (dispositivo acoplado a la carga, esencialmente una cámara digital) que está conectado a una computadora con un software de análisis de imágenes.

Antecedentes

El concepto que subyace al ensayo SCGE es que el ADN no dañado conserva una asociación altamente organizada con las proteínas de la matriz en el núcleo. Cuando está dañado, esta organización se ve afectada. Las cadenas individuales de ADN pierden su estructura compacta y se relajan, expandiéndose fuera de la cavidad hacia la agarosa. Cuando se aplica el campo eléctrico, el ADN, que tiene una carga negativa general, se dirige hacia el ánodo cargado positivamente. Las hebras de ADN no dañadas son demasiado grandes y no salen de la cavidad, mientras que cuanto más pequeños son los fragmentos, más lejos están en libertad de moverse en un período de tiempo determinado. Por lo tanto, la cantidad de ADN que sale de la cavidad es una medida de la cantidad de daño del ADN en la célula.

El análisis de imagen mide la intensidad general de la fluorescencia para el nucleoide completo y la fluorescencia del ADN migrado y compara las dos señales. Cuanto más fuerte es la señal del ADN migrado, más daño hay presente. La estructura general se asemeja a un cometa (de ahí el "ensayo del cometa") con una cabeza circular correspondiente al ADN no dañado que permanece en la cavidad y una cola de ADN dañado. Cuanto más brillante y larga sea la cola, mayor será el nivel de daño.

El ensayo del cometa es una técnica versátil para detectar daños y con ajustes en el protocolo se puede utilizar para cuantificar la presencia de una amplia variedad de lesiones que alteran el ADN (daño). El daño generalmente detectado son roturas de un solo filamento y rupturas de doble filamento. A veces se afirma que las condiciones alcalinas y la desnaturalización completa del ADN son necesarias para detectar roturas de cadena sencilla. Sin embargo, esto no es cierto, también se detectan roturas de cadena simple y doble en condiciones neutras. Sin embargo, en condiciones alcalinas, se detectan estructuras de ADN adicionales como daños en el ADN: sitios AP (sitios abasicos a los que les falta un nucleótido de pirimidina o purina) y sitios donde se está realizando la reparación por escisión.

El ensayo del cometa es un ensayo de daño de ADN extremadamente sensible. Esta sensibilidad debe manejarse con cuidado, ya que también es vulnerable a los cambios físicos que pueden afectar la reproducibilidad de los resultados. Esencialmente, se debe evitar cualquier cosa que pueda causar daño o desnaturalización del ADN, excepto los factores que se investigan. La forma más común del ensayo es la versión alcalina, aunque todavía no existe un protocolo de ensayo alcalino definitivo. Debido a su configuración simple y económica, se puede utilizar en condiciones en las que no se dispone de ensayos más complejos.

Aplicaciones

Estos incluyen pruebas de genotoxicidad, biomonitoreo humano y epidemiología molecular, ecogenotoxicología, así como investigación fundamental en daños y reparación de ADN.

Fragmentación del ADN espermático

Un ensayo de cometa puede determinar el grado de fragmentación del ADN en las células de esperma. El grado de fragmentación del ADN se ha asociado con los resultados de la fertilización in vitro.

El cometa ha sido modificado para su uso con células de esperma como herramienta para el diagnóstico de infertilidad masculina.

Para descomponer estas proteínas de protamina fuertemente unidas para utilizar el cometa para esperma, se requieren pasos adicionales en el protocolo de descondensación.